产品货号:
GS0146
中文名称:
一管式RT-PCR试剂盒
英文名称:
One-Step RT-PCR Kit(M-MuLV)
产品规格:
10次|100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒以RNA为模板,RNA→cDNA→PCR在同一体系中连续进行,反应过程中无需添加试剂,无需开盖,避免了污染。一步法RT-PCR技术可用于RNA分子的检测和结构分析、cDNA克隆、RNA水平上的特定的基因表达分析等多种领域的应用。
本试剂盒采用高质量的M-MuLV反转录酶和Taq DNA聚合酶,以及本公司研发的反应体系,大大提高了反应的扩增性能和特异性。本试剂盒已将RT-PCR反应中用到的Buffer、dNTP及体系稳定剂配成10×One-Step RT-PCR Buffer,使得实验操作更加方便。
组分 | 10次 | 100次 |
10×One-Step RT-PCR Buffer | 100μL | 1mL |
M-MuLV RTase | 7μL | 50μL |
Taq DNA polymerase | 7μL | 50μL |
RNase inhibitor | 7μL | 50μL |
RNase-free ddH2O | 1mL | 2mL |
MgCl2 (5mM) | 1mL | 2mL |
保存:-20℃
- RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液37℃处理12h;然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
- 用于RNA实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60min)或者上述DEPC处理的器具盛装,使用的无菌水须用0.1% DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
- 使用本试剂盒进行RT-PCR反应时,应使用基因特异性引物(GSP),不能使用Oligo dT及随机引物,否则将会导致RT-PCR产生非特异性产物,目标RT-PCR产物的产量也会减少。
- 当同时进行多次RT-PCR反应时,应将各种试剂配制成混合液然后分装到各个管中,以减少实验操作或实验之间的误差(整个反应过程应在冰浴条件下进行)。
- 本试剂盒中的反转录酶可在37~50℃条件下正常工作,45℃为该酶的最适温度。对于富含GC二级结构的RNA,可以适当提高反转录的工作温度,但是温度超过50℃ RT-PCR产物的得率会有所降低。
- 对于大多数模板而言,镁离子终浓度在1.2mM效果较好,如果需要可用提供的5mM MgCl2来进一步调节至更为合适的浓度(通常在1.2~2.0mM之间)。
- 待模板RNA、10×One-Step RT-PCR Buffer、特异性引物溶解后,轻微短暂离心,然后冰浴放置。
- 在冰浴的试管中加入如下RT-PCR反应混合物:
成分 用量 10×One-Step RT-PCR Buffer 5μL 正向引物(10μM) 2μL 反向引物(10μM) 2μL M-MuLV RTase 0.5μL RNase inhibitor 0.5μL Taq DNA polymerase 0.5μL 模板RNA X μL RNase-free ddH2O 至50μL - 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应
温度 时间 循环数 45℃ 10~30min 1 94℃ 5min 1 94℃ 30sec 30~40 40~65℃ 30sec 72℃ 1kb/min 72℃ 10min 1 - 退火温度:根据实际情况,可适当的在40~65℃之间降低或升高退火温度。
- 延伸时间:根据目的产物的长度而定,一般情况下1 kbp需设定时间1min左右。
- 循环次数:通常情况下设定为30~40个循环,cDNA量较少时可适当增加循环次数。
- 退火温度:根据实际情况,可适当的在40~65℃之间降低或升高退火温度。
- 反应结束后,取5~10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
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